该法的局限性在于检测周期较长，1次噬斑检测的细胞培养通常需要5~7 d，消耗大量时间和人力成本。且此方法的重复性较差，误差难以避免，需要多组重复实验取均值。
2.2
TCID50分析法
一些病毒在感染宿主细胞后大量增殖使宿主细胞产生细胞病变效应，如细胞的大小、形状、贴壁状态等特征发生变化甚至死亡。将待检测样本接种到特定的细胞系中观察是否出现细胞病变效应，以此判断病毒的活性，可通过对待测样本的梯度稀释计算出病毒的滴度。该方法适用于已知病毒样本的活力测定，且需要选择对病毒敏感的细胞作为宿主，常用于验证病毒灭活处理的灭活效果。如王春等以TCID50法分别测算消杀前后样品中病毒的滴度，评价3种不同消毒原理的消毒机对流感病毒气溶胶的消灭效果。
TCID50法和噬斑法均是基于细胞培养的测定活病毒滴度的常用方法，由于噬斑法得到的噬斑形成单位表示的是病毒具体浓度，而TCID50/ml所表示的是统计细胞病变情况而估算的大致病毒浓度。因此噬斑法比TCID50法具有更高的精确度，但TCID50法可一定程度上弥补噬斑法对操作误差的敏感，得到相对准确的结果。由于传统的细胞培养病毒检测方法往往耗时长、复杂且需要实验室环境，限制了其在紧急情况下的应用，因此TCID50法具有实际应用方面的意义。
3
免疫学方法
3.1
抗原检测法
通过抗原抗体特异性结合的免疫学原理，以病毒的特定蛋白结构作为抗原，使用特异性抗体进行检测，可确定人体或动物体内是否存在病毒感染。基于抗原的检测常用方法有ELISA、免疫印迹法、免疫荧光分析以及胶体金免疫层析检测等。抗原检测法适用于病毒感染的早期诊断，可以快速获得结果。马家秀等开发了1种HBV核心相关抗原定量检测试剂盒，检测灵敏度为1.43 pg/ml，能够较准确地反映慢性乙型肝炎患者血清中的抗原水平，在辅助治疗和监测判定治疗重点等方面具有重要的应用价值。Wang等以水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E为目标抗原开发了1种针对该病毒的胶体金检测试纸，检出下限为30 ng/ml，该方法具有操作简单、成本较低的优势，适用于大规模筛查和快速诊断。
然而，抗原检测法的灵敏度易受到环境因素和受试者自身因素的影响，例如当患者接种了针对相应病原体的疫苗后，短时间内进行抗原检测可能造成假阳性；抗原抗体特异性结合的最适pH约为6~9，如患者在咽拭子样本采集前食用了酸性或碱性食物则可能导致假阴性；当患者自身产生的特异性中和抗体亲和力高于检测用抗体，同样可能造成假阴性。
3.2
抗体检测法
抗体检测法通过检测人体对病毒产生的特异性抗体以确定机体的感染状态。卞论等建立了抗人狂犬病病毒抗体ELISA定量检测方法，检出下限为0.03 IU/ml，可用于人用狂犬病疫苗的免疫效果初步评价。刘金月等建立了基于登革病毒糖蛋白E的萤光素酶免疫吸附法，用于检测登革病毒的特异性IgG抗体，可在20 h内获得检测结果，适用于登革病毒感染的筛查、监测预警、流行病学调查等。
抗体检测法具有应用范围广泛、能够评估免疫应答状态的优势。然而其缺点在于，机体在感染病毒后激活免疫应答产生特异性抗体的过程需要时间，因此该方法在早期感染阶段可能不敏感，容易发生漏检。同时抗体检测法也存在交叉反应和抗体水平变化的问题，需要结合实际应用不断调整优化。
3.3
免疫组织化学法
免疫组织化学法是将待检测的组织或细胞进行固定、通透处理后，利用抗原抗体特异性结合的原理进行免疫组织化学染色，并在显微镜辅助下观察。解中等探索鸭源性H6N1禽流感病毒在猪和人呼吸道感染特点时，将组织切片脱蜡水化后抗原修复，内源性过氧化物酶阻断，非特异性染色阻断剂封闭，后用鼠抗禽流感病毒核蛋白抗体作为一抗，生物素标记的羊抗兔/鼠IgG聚合物作为二抗，加入链霉菌抗生素-过氧化物酶，二氨基苯联胺显色，在猪气管、肺部组织和人肺组织中检测到病毒的抗原，从而提示H6N1有可能感染人和猪的呼吸系统。免疫组织化学法虽有助于病毒在感染部位的定位和病理分析研究，可为抗病毒工作的开展提供引导，但其步骤较为繁琐，不适用于大规模的检测工作。
4
核酸诊断方法
4.1
PCR
PCR是1种常用的病毒检测方法，通过将病毒的DNA片段特异性扩增，对样品进行琼脂糖凝胶电泳来观察扩增结果从而判断样品中病毒的存在。其扩增产物量以指数方式增加，经过30~40个循环后理论上1个靶DNA分子可扩增至10亿个。由于基因的特异性，核酸检测可以快速获得高度准确的检测结果。且可根据目的片段的长度不同，在同一检测体系内同时检测多个病毒。门旭坤等建立了1种可以同时检测3种导致猪呼吸道综合征病毒的多重PCR方法，检测下限约为2×105 拷贝，且特异性良好，可用于3种病毒的临床快速检测与流行病学调查。
然而，对于PCR扩增结果只能观测到不同大小的DNA片段，难以进行底物的准确定量，且PCR技术需要严格的实验条件，包括实验室设备、环境条件和专业的操作人员。
4.2
定量PCR（quantitative PCR，qPCR）
qPCR是在PCR技术的基础上发展出来的，其原理是在PCR反应体系中加入荧光物质以实现对目的核酸片段扩增的实时定量。qPCR检测荧光强度可直接在电脑中读取并处理数据，比PCR简便；且相比PCR，qPCR可对病毒进行精确定量，判断样品中的病毒载量。qPCR根据添加荧光物染料的原理不同，一般又可分为荧光染料法和TaqMan探针法。
SYBR Green Ⅰ染料可与双链DNA结合并发出较强荧光，因此荧光强度与体系中扩增片段浓度呈线性关系，可计算得到待测底物中的病毒量。陈佳圣等建立鸡圆环病毒的SYBR Green ⅠqPCR检测方法，检出限为287 拷贝/μl，灵敏度比常规PCR高100倍。此方法成本相对较低，只需要针对目的片段设计特异性的引物即可进行检测。由于染料与双链DNA的结合是非特异性的，每次实验只能针对1种病毒进行检测，且可能出现非特异性扩增造成假阳性。
TaqMan探针法则是在1段与目的扩增片段特异性结合的探针两端分别添加荧光基团和淬灭基团，当两基团连接在1条探针链上时，荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。探针在扩增过程中被Taq酶切割，使两端基团远离，从而能检测到荧光信号，且荧光强度与扩增目的片段数量成正比。张峰等建立检测人疱疹病毒6型、7型的单一实时qPCR方法，检测下限达到103 拷贝，检测灵敏度高于常规PCR方法。与荧光染料法相比，TaqMan探针法可避免非特异性扩增的干扰，特异性更强；还可针对多个的目的片段分别设置携不同荧光信号的探针，同时检测多个目的片段，提高检测准确性的同时还提升了检测效率，可以对同一样本同时检测多种病毒。但其特异性的探针需要定制，投入成本较前者高。此外，qPCR法测得结果中包含已失活病毒颗粒的DNA含量，无法判断病毒的感染活力。
4.3
反转录PCR（reversal tranion PCR，RT-PCR）
由于有些病毒的基因组由RNA组成，因此不能直接进行PCR检测，必须先将RNA逆转录得到相应的互补DNA，再进行扩增步骤。RT-PCR方法同样可以结合荧光染料或探针对目的片段进行实时定量分析，称为RT-qPCR，该法同样具有特异性强、灵敏度高的特点。张伟等建立了1种结合荧光染料的柯萨奇病毒B组3型RT-PCR检测法，特异性良好，检测范围101~109 拷贝/ml。Yan等建立了1种结合探针的多重RT-PCR技术，可同时检测禽流感病毒H1、H2、H3亚型，检测下限达到10~100 拷贝。除了用于定量病毒基因组，针对mRNA的特异性检测还可用于测定不同时期或组织中特定基因的转录活跃程度，这对于探索病毒的生物学活性机制具有很大的帮助。Bartolomeo等将新型冠状病毒接种于不同组织来源的人源细胞系，并通过RT-PCR检测病毒入侵细胞的重要受体和辅助蛋白受体血管紧张素转换酶2、跨膜丝氨酸蛋白酶2的mRNA，来评估其在不同人体组织中的表达活跃程度，以探究新型冠状病毒对人体的器官或组织嗜性。
由于RNA的单链结构不稳定易在体外分解，可能造成检测结果偏低，因此在检测和样品储存上对实验人员操作及环境的洁净度有较高的要求，在一定程度上提高了成本。
4.4
等温扩增技术
利用等温扩增技术可在恒定温度下进行核酸高效特异性扩增。区别于传统PCR扩增技术的循环升温、退火程序，等温扩增技术只需在温和且恒定环境下即可进行，最适反应温度在37~65 ℃之间，根据检测体系中是否发生特异性扩增判断目标病毒的存在，结果通过光学或电化学方法判读。常用的等温扩增技术包括环介导等温扩增技术、重组酶介导扩增技术、交叉引物扩增技术、链置换扩增技术，转录介导扩增技术（tranion-mediated amplification，TMA）等。在定量检测血浆样本中的HBV和HCV时，TMA被证明与RT-PCR检测结果具有高度的相关性，在感染患者的诊断中可被相互替代 。等温扩增技术省去了需要严格控温的热循环仪器的实验室条件，也省去了反复变温所消耗的时间，可在常见的保温设备中进行扩增，使检测工作变得快速、便捷，同时也节省了检测成本。在新型冠状病毒的临床检测应用中，TMA对新型冠状病毒RNA检测的灵敏度高于通用的RT-PCR方法。
由于从流行病学角度出发，TMA过高的敏感性可能导致难以区分需要治疗的感染者和病毒载量低的无症状感染者，在大流行中可能会影响医疗资源的合理分配，因此需要与其他方法及临床经验相结合来使用。
4.5
成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-CRISPR相关蛋白（CRISPR associated protein，Cas）检测法
CRISPR-Cas是1种新型病毒检测技术，其本质也是利用核酸的特异性互补配对原理进行检测。当细菌受到病毒感染后，会将病毒的DNA片段整合到细菌基因组中，形成CRISPR序列。Cas是一系列与CRISPR相互作用的蛋白，其中Cas13/Cas12可与目标基因片段特异性结合并被激活RNA或DNA内切酶活性，导致周围的核酸分子被非特异性切割。通过检测报告器释放的发光、荧光或电化学信号，确定待测样品中是否存在目标病毒。王彦贺等建立了1种基于CRISPR-Cas13的埃博拉病毒检测方法，检测下限低至1 拷贝/μl，相比普通PCR法灵敏度提高了至少10倍，为实现痕量埃博拉病毒的现场检测提供了新方法。Chen等基于CRISPR-Cas12建立了1种快速便捷的可视化猴痘病毒检测方法，将检测时间缩短至35 min。
CRISPR-Cas技术的优势在于特异性强、灵敏度高，同时由于其不需要目的片段扩增，可以简单、快速地获得结果。但其引物设计相对复杂，需要考虑引物的特异性和结构等因素，需要一定的专业知识和经验支持。
4.6
高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）
HTS的成本较高，尤其对于人群大范围筛查，相对于特异性精确诊断的方法，HTS并不具有更高的性价比，而是更适用于对未知病毒基因的大范围研究。Kawasaki等提出为了应对人畜共患感染病，对动物样本大范围取样进行HTS建立病毒宏基因组；Cebriá-Mendoza等提出对人血浆采样进行HTS建立病毒宏基因组，以便于对未知病毒提前发觉，防患于未然。
5
组合方法
为了进一步开发灵敏度、准确性更高的病毒检测方法，研究者们将多种检测技术结合形成新的检测体系，从而将不同技术的优势结合起来以达到更佳的效果。
有研究者开发了PCR-ELISA联用法，在PCR扩增时使用生物素标记的引物，然后用ELISA检测生物素含量即可定量病毒，将2种方法结合用以检测猪瘟病毒，其灵敏度比普通PCR检测法高约100倍，且在确保准确率的同时简化了操作步骤，降低了检测成本，为猪瘟的流行病学监测提供有力帮助。Gootenberg等将CRISPR-Cas13系统和环介导等温扩增技术相结合，开发了1种分子检测平台并命名为SHERLOCK，进一步提升了CRISPR-Cas系统的检测精度，便携式平台的建立也将为众多科研工作带来便利。
生物芯片技术是通过微加工和微电子等微缩技术将特定蛋白或核酸序列固定于芯片表面，并依靠分子间的特异性相互作用来检测病毒的方法。其中载体材料和固定的生物分子都可依据检测需求来选择，常用的方法可分为基于抗原抗体特异性结合原理的蛋白质芯片，和基于核酸互补配对原理的基因芯片。1块芯片上能够固定多个抗体或核酸探针，因此可以同时进行多种病毒的检测，提高了效率和检测范围。芯片实验室又称微全分析系统，是以微刻技术为基础、在芯片上进行多种生化分析方法的高度自动化系统，如将PCR等核酸检测技术或免疫荧光技术集成于芯片中，并设计可由电脑操控的自动化检测程序。该方法具有高通量、多重检测、高度自动化的优势，且具有较高的包容性。随着科技的进步，芯片系统也可与未来的新技术结合，从而不断优化自身。由新型冠状病毒引发的全球性疫情给全球公共卫生和医疗系统带来了巨大的挑战，大范围筛查工作提示需要发展高通量、自动化的检测系统以缩减人员成本。新型冠状病毒感染疫情以来，已有大量研究提出基于芯片技术的新型冠状病毒检测方法，其中一些在抗击疫情工作中做出了重要贡献。Xing等建立了集成式微流控核酸分析系统用于新型冠状病毒的检测，将样本采集、灭活、核酸提取和等温扩增等步骤形成自动化机械操作，其检测灵敏度可在45 min内达到150 拷贝/ml，且经过评价，检测结果与RT-qPCR法结果高度一致。由于芯片的设计和制备需要专业设备和技术，成本较高，且与CRISPR-Cas、等温扩增等技术的结合也使得该系统的成本高于传统方法，如何在保留其快速、精准的优势同时缩减检测成本仍是芯片技术的热门议题。
6
结论与展望
本文对多种病毒检测方法进行了总结，各种检测方法都有其特定的优势和局限性。综合考虑敏感性、特异性、操作便捷性、实验条件场景以及成本效益比等因素，选择相适应的检测方法是十分重要的环节。
传统的细胞培养病毒检测方法可以反映病毒样品的滴度，为病毒灭活条件的摸索提供指导，但往往耗时长、操作复杂且需要实验室环境，限制了其在紧急情况下的应用。基于免疫学原理的抗原或抗体检测法成本较低、检测快速简便，适用于大范围传染病排查及现场即时检测，但易受到环境等因素的影响导致灵敏度和准确性不足。免疫组织化学法可用于病毒感染病理的研究，为病毒的防治提供思路。PCR、qPCR等检测方法在灵敏度上有所提升，适用于病毒流行病学监测和小样本的精准检测，但此类方法需要专业的仪器设备和技术人员操作，在大规模排查时消耗大量时间和人力物力资源。基于核酸检测的CRISPR-Cas方法、等温扩增等新兴检测技术通常具有高灵敏度、高特异性、响应速度快、高度自动化的特点，有潜力应用于现场即时检测和大范围筛查；同时新兴技术也伴随更高的开发成本、技术门槛和尚未完善的标准化体系。随着科技的进步和创新，病毒检测技术还有很多潜在的发展方向和改进空间，可以进一步提高病毒检测的准确性、灵敏度和速度。例如，基于纳米技术的病毒检测方法、新型放大技术的引入以及人工智能算法的应用，都有望为病毒检测带来革命性的突破。面对潜在的传染病威胁，病毒检测技术的发展趋势应是在保有较高灵敏度的基础上提升检测效率，并降低对检测环境条件和人员专业性的要求。未来的发展趋势可能包括微型化和便携式设备的开发，以便在疫情暴发或偏远地区进行快速检测。
同时，与其他领域的交叉合作也将推动病毒检测技术的进一步创新，如材料、光学等领域为生物检测的应用带来了生物芯片、电镜等新技术，并在其领域内不断创新优化。病毒检测技术在不同的领域有很多其他应用，除了临床诊断和流行病学调查监管，还可应用于疫苗研发和评估、食品水源安全、动物防疫等诸多方面。除了被动地检出和防御，高通量测序技术的发展也为病毒学研究提供了有力的工具。新型冠状病毒流行对全球的影响也提示我们要化被动为主动，在病毒造成威胁前先一步探索病毒。随着技术的不断发展，病毒检测技术将继续为人类健康和公共安全做出更大的贡献。
作者
曹鹤宵综述 李冬梅审校
通信作者：李冬梅，
Email：alhal@163.com
引用本文：曹鹤宵, 李冬梅. 病毒检测方法的研究现状与展望 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(6): 390-396. 返回搜狐，查看更多